Метод хроматографии на бумаге относится к плоскостной хроматографии, он основан на распределении анализируемых веществ между двумя несмешивающимися жидкостями.

В распределительной хроматографии разделение веществ происходит вследствие различия коэффициентов распределения компонентов между двумя несмешивающимися жидкостями. Вещество присутствует в обеих фазах в виде раствора. Неподвижная фаза удерживается в порах хроматографической бумаги, не взаимодействуя с ней, бумага выполняет функцию носителя неподвижной фазы.

Виды хроматографической бумаги:

1) гидрофильная бумага удерживает в порах до 22 % воды; неподвижная фаза – вода, подвижная – органический растворитель; такая бумага применяется для определения водорастворимых веществ.

2) гидрофобная бумага отталкивает воду, поэтому ее пропитывают неполярным органическим растворителем (неподвижная фаза); подвижная фаза – вода; такая бумага применяется для определения нерастворимых в воде соединений (жирорастворимые кислоты, витамины).

К хроматографической бумаге предъявляются следующие требования:

¨ химическая чистота;

¨ химическая и адсорбционная нейтральность по отношению к анализируемым веществам и подвижной фазе;

¨ однородность по плотности;

¨ одинаковая направленность волокон.

Для получения хроматограммы на бумагу наносят каплю анализируемой смеси. Бумагу помещают в хроматографическую камеру, ее конец погружают в сосуд с элюентом. Растворитель продвигается по бумаге, смесь анализируемых веществ распределяется между подвижной и неподвижной фазами и разделяется на бумаге в виде пятен или полос. Положение зон компонентов определяют проявлением хроматографической бумаги соответствующими реагентами, которые с компонентами разделяемой смеси образуют окрашенные соединения.

Для количественной оценки способности разделения веществ в хроматографической системе применяют коэффициент распределения К р – отношение концентрации вещества в неподвижной и подвижной фазах. Экспериментальное установление коэффициентов распределения в данном методе невозможно, для оценки способности разделения веществ на бумаге применяют коэффициент смещения (подвижности) R f . Коэффициент смещения равен отношению скорости движения вещества () к скорости движения подвижной фазы (). Экспериментально величину R f находят как отношение расстояния Х, пройденного веществом, к расстоянию Х f , пройденному растворителем от старта до линии фронта:

.

Коэффициент R f изменяется в пределах 0 – 1,00. Величина R f зависит от природы определяемого вещества, вида хроматографической бумаги, качества и природы растворителя, способа нанесения пробы, техники эксперимента и температуры. Коэффициент R f не зависит от концентрации определяемого вещества и присутствия других компонентов.

Идентификацию по хроматограмме выполняют следующими способами:

¨ визуальным сравнением характерной окраски зон веществ на исследуемой и стандартной хроматограммах;

¨ измерением коэффициентов подвижности R f для стандартного и анализируемого вещества в определенном растворителе. Хроматографирование и установление R f для исследуемой и стандартной смесей проводят на одинаковой бумаге и в одной камере в строго идентичных условиях. Сопоставляя коэффициенты R f , делают заключение о присутствии в анализируемой смеси тех или иных компонентов.

Количественное определение выполняют непосредственно по хроматограмме или при вымывании (элюировании) анализируемого вещества с бумаги.

Способы количественного анализа:

¨ визуальное сравнение интенсивности окраски пятен на исследуемой и стандартной хроматограммах (полуколичественное определение, точность 15 –20 %);

¨ измерение площади пятна, образованного данным компонентом, и нахождение концентрации вещества по градуировочному графику, построенному для серии стандартных растворов в координатах: площадь пятна – концентрация вещества; точность определения 5 – 10 %;

¨ элюирование определяемого вещества с поверхности хроматограммы и спектрофотометрическое или флуориметрическое измерение оптической плотности элюата (А); концентрацию вещества в растворе рассчитывают по формуле:

где К – коэффициент пропорциональности; S – площадь пятна, измеренная предварительно, мм 2 ; точность определения 1 %.

По способу хроматографирования различают восходящую (рис. 21), нисходящую (рис. 22), круговую (рис. 23), градиентную и двухмерную хроматографии.

Метод хроматографии на бумаге широко применяется для определения неорганических соединений, аминокислот, аминов, белков, углеводов, жирных кислот, фенолов, витаминов в химической, пищевой, фармацевтической промышленности, медицине, биохимии.

Метод нашел применение в анализе практически всех пищевых продуктов: в сахарном производстве – для определения углеводов; в хлебопекарном и кондитерском – аминокислот, органических кислот, углеводов, полисахаридов и карбонильных соединений; в виноделии – органических кислот и аминокислот; в производстве молока и молочных продуктов – аминокислот; в мясоперерабатывающей промышленности – фенолов, жирных и летучих кислот, аминокислот и карбонильных соединений.

Хроматография на бумаге (БХ)

Впервые метод бумажной хроматографии применили для разделения и идентификации аминокислот в 1943 г. В зависимости от природы процесса разделения БХ принято классифицировать как распределительную, адсорбционную и ионообменную. Методика БХ

(как и тонкослойной хроматографии) проста и оперативна, что в сочетании с требуемыми микроколичествами анализируемых веществ объясняет широкое распространение метода.

При хроматографировании на бумаге разделение анализируемых веществ происходит в результате многократных актов адсорбции на целлюлозе бумаги (или абсорбции в воду, пропитывающей бумагу) - в неподвижной фазе и актов десорбции в элюирующий раствор - в подвижной фазе. Бумага должна быть однородной по плотности, химически и адсорбционно-нейтральной. В настоящее время промышленность России выпускает четыре сорта хроматографической бумаги № 1, 2, 3, 4. Каждый номер отличается по плотности, следовательно, и по скорости движения растворителя. Бумагу № 1 и 2 называют «быстрой», а № 3 и 4 - «медленной». Выпускают и специальные сорта бумаги с высоким содержанием карбоксильных групп (для разделения катионов), а также - бумаги, содержащие иониты или другие адсорбенты.

Этот процесс проходит следующим образом. На полоску хроматографической бумаги наносят каплю раствора, содержащую смесь веществ, и дают ей высохнуть. Далее один конец бумаги опускают в сосуд с подходящим растворителем и его плотно закрывают.

Растворитель, двигаясь под действием капиллярных сил вдоль полоски бумаги, захватывает компоненты анализируемой смеси. В результате процессов сорбции - десорбции происходит разделение смеси на отдельные компоненты. Так же как и в тонкослойной хроматографии, качество разделения зависит от величины коэффициентов распределения компонентов - R/, характеризующих относительную скорость их перемещения по бумаге. Для качественного разделения на бумаге значения R/ компонентов должны быть в пределах 0,05-0,85.

Методика проведения анализа на хроматографической бумаге аналогична методике тонкослойной хроматографии. Существует несколько ее вариантов: одномерная, двухмерная, круговая и электрофоретическая. Как и в тонкослойной хроматографии, метод одномерной и двухмерной хроматографии предполагает восходящие или нисходящие потоки растворителя.

Выбор подходящего растворителя - достаточно сложная задача. Этот компонент, так же как и анализируемые вещества не должны резко отличаться по полярности и гидрофильным свойствам, иначе они или останутся на линии старта, или будут двигаться вместе с фронтом растворителя. Если вещество исследуемой системы остается на стартовой линии, это свидетельствует о его малой растворимости в подвижной фазе, в этом случае следует применить более полярный растворитель. Если же, наоборот, вещество движется вместе с фронтом растворителя (/?/= 1), то это означает, что оно слабо взаимодействует с неподвижной фазой, и для анализа следует выбрать менее полярный растворитель. Для сильногидрофильных веществ применяют смеси с высоким содержанием воды, например, насыщенный водой вторичный бутанол, верхнюю фазу смеси н-бутанола, уксусной кислоты и воды (4:1: 5), систему изопропанол - аммиак, уксусную кислоту 15 % и т.п.

Вещества средней гидрофильное™, которые экстрагируются из воды этилацетатом, но не экстрагируются бензолом, хроматографируют с помощью растворителей средней полярности, например бу- тилацетатом или хлороформом с небольшими добавками полярных веществ или воды.

Для разделения веществ, практически не растворимых в воде, обычно в качестве элюентов используют бензол или циклогексан.

Иногда для оценки свойств веществ анализируемой смеси проводят ее предварительное хроматографирование (обычно в системе бутилацетат - вода). В зависимости от установленных таким способом величин R/ анализируемых веществ далее выбирают либо более полярные, либо неполярные смеси.

Так же как в тонкослойной хроматографии, для детектирования отдельных компонентов хроматограммы обрабатывают соответствующими реактивами, при взаимодействии которых с компонентами анализируемой смеси образуются окрашенные соединения. Количественное определение производят путем визуального сравнения интенсивности окраски или флуоресценции пятен пробы и стандартов, либо путем измерения размера пятна, предварительно определив зависимость между количеством вещества и размером его пятна на хроматограмме. Также возможно извлечение веществ из хроматографических пятен с последующим их физико-химическим анализом.

ГОСТ 28365-89

Группа Л59

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

РЕАКТИВЫ

Метод бумажной хроматографии

Reagents. Method of paper chromatography

МКС 71.040.30
ОКСТУ 2609

Дата введения 1991-01-01

ИНФОРМАЦИОННЫЕ ДАННЫЕ

1. ВНЕСЕН Министерством химической промышленности СССР

2. Постановлением Государственного комитета СССР по управлению качеством продукции и стандартам от 13.12.89 N 3708 стандарт Совета Экономической Взаимопомощи СТ СЭВ 6397-88 введен в действие непосредственно в качестве государственного стандарта СССР с 01.01.91

3. ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

4. ССЫЛОЧНЫЕ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИЕ ДОКУМЕНТЫ

5. ПЕРЕИЗДАНИЕ. Май 2008 г.


Настоящий стандарт распространяется на химические реактивы и устанавливает метод проведения испытания, основанный на бумажной хроматографии.

Термины, применяемые в стандарте, и их пояснения приведены в приложении 2. Рекомендуемые области применения метода приведены в приложении 3.

1. ОБЩИЕ УКАЗАНИЯ

1. ОБЩИЕ УКАЗАНИЯ

1.1. При проведении испытаний должны быть соблюдены требования ГОСТ 27025 .

1.2. В нормативно-технической документации на испытуемый реактив должны быть указаны следующие данные:

1.2.1. Описание приготовления испытуемого раствора.

1.2.2. Предварительная обработка (при необходимости).

1.2.3. Используемые растворители (или смесь).

1.2.4. Применяемые реактивы и растворы.

1.2.5. Способ хроматографирования.

1.2.6. Тип хроматографической бумаги, необходимость предварительной пропитки бумаги, пропитывающие растворы, продолжительность сушки после пропитки (при необходимости).

1.2.7. Время насыщения хроматографической камеры парами подвижной фазы.

1.2.8. Объем испытуемого раствора, наносимый на бумагу.

1.2.9. Температура, при которой проводят хроматографирование (при необходимости).

1.2.10. Критерии окончания процесса хроматографирования.

1.2.11. Способ проявления хроматограмм и реагенты для проявления (при необходимости).

1.2.12. Способ оценки хроматограмм.

1.2.13. Вещества сравнения, используемые для оценки (при необходимости).

1.2.14. Аппаратура для количественной оценки разделенных компонентов (при необходимости).

2. СУЩНОСТЬ МЕТОДА

Метод заключается в разделении на хроматографической бумаге смеси веществ в потоке растворителя, основанном на различной скорости перемещения компонентов смеси.

3. АППАРАТУРА И МАТЕРИАЛЫ

3.1. Камера (сосуд) хроматографическая, закрытая герметичной крышкой.

3.2. Лампа ультрафиолетовая для обнаружения веществ с использованием флуоресценции при длине волны от 254 до 366 нм.

3.3. Микропипетка вместимостью 0,002-0,010 см или микрошприц вместимостью не более 0,01 см.

3.4. Пульверизатор для распыления проявителя.

3.5. Бумага хроматографическая.

3.6. Денситометр.

3.7. Устройство для сканирования пятен на бумаге.

4. ПОДГОТОВКА К ИСПЫТАНИЮ

4.1. Подготовка хроматографической бумаги

В зависимости от размеров хроматографической камеры из хроматографической бумаги вырезают полоски с ровной или зубчатой кромкой или кружки соответствующих размеров, на которых мягким карандашом обозначают пробу, систему растворителей, дату и линию старта с точками для нанесения пробы. Рекомендуемое расстояние между точками для нанесения пробы 20-30 мм, расстояние от линии старта до кромки бумаги - 30 мм.

При необходимости перед испытанием бумагу обрабатывают специальным раствором и высушивают при комнатной температуре в вертикальном положении стартом вниз.

4.2. В точки, отмеченные на линии старта, наносят с помощью калиброванной микропипетки или микрошприца 0,002-0,010 см испытуемого раствора, если в нормативно-технической документации на испытуемый реактив нет других указаний. При необходимости в точки на линии старта наносят таким же образом растворы веществ, соответствующих предполагаемым компонентам смеси, для идентификации и количественной оценки этих примесей. Допускается наносить пробу не в виде точки, а чертой с применением микропипетки или капилляра. После нанесения пробы на непропитанную бумагу растворителю дают свободно испариться. Если проба не содержит летучих компонентов, а бумага не пропитана органической неподвижной фазой, испарение растворителя можно ускорить струей горячего воздуха. Бумагу с нанесенной пробой помещают в хроматографическую камеру (пропитанные бумаги помещают в камеру сразу после нанесения раствора пробы).

При круговой хроматографии пробы наносят на окружность, описанную на расстоянии нескольких сантиметров от центра хроматограммы.

5. ПРОВЕДЕНИЕ ИСПЫТАНИЙ

5.1. Хроматографирование

Хроматографическое разделение веществ проводят в хроматографической камере, в замкнутой системе, насыщенной парами подвижной фазы, при температуре, указанной в нормативно-технической документации на испытуемый реактив, поместив эту фазу в чашку на дно камеры. Если в нормативно-технической документации на испытуемый реактив нет других указаний, хроматографирование заканчивают, когда фронт подвижной фазы достигнет определенного расстояния от старта, например 250 мм. Хроматографирование проводят одним из указанных ниже способов.

5.1.1. Нисходящая хроматография

В камере для нисходящей хроматографии должен быть желобок или лодочка. Конец листа хроматографической бумаги с нанесенными пробами, ближний к линии старта, дважды перегибают, помещают в желобок или лодочку, закрепляют стеклянной палочкой, как показано на черт.5 приложения 1. Затем в желобок помещают подвижную фазу.

5.1.2. Восходящая хроматография

Хроматографическую бумагу подвешивают в хроматографической камере так, чтобы ее нижний конец был погружен в слой подвижной фазы на дне сосуда, как показано на черт.4 приложения 1, а уровень подвижной фазы находился на 10 мм ниже линии старта.

5.1.3. Горизонтальная хроматография

Испытания проводят, как показано на черт.2 приложения 1.

5.1.4. Круговая хроматография

При круговой хроматографии подвижную фазу помещают в середину хроматограммы, откуда она передвигается к периферийной части, как показано на черт.3 приложения 1. В качестве хроматографической камеры допускается использовать две чашки Петри или эксикатор.

5.1.5. Проточная хроматография

Если хроматографируемые вещества имеют в определенной системе низкие значения , нижнюю кромку нисходящей хроматограммы делают зубчатой. Когда подвижная фаза достигнет конца хроматограммы, разделение продолжают так, чтобы элюирующий растворитель стекал по каплям на дно камеры.

5.1.6. Повторная хроматография

Метод, при котором по завершении первого продвижения подвижной фазы хроматограмму высушивают и хроматографирование повторяют (возможно несколько раз).

5.1.7. Многомерная хроматография

Метод, при котором по завершении первого продвижения подвижной фазы хроматограмму поворачивают (например, под углом 90°) и снова проводят хроматографирование. Перед повторным хроматографированием испаряют подвижную фазу.

5.2. Сушка хроматограмм

По окончании разделения хроматограмму вынимают из камеры и отмечают фронт мягким карандашом, после чего сушат при комнатной температуре в вертикальном положении, стартом вниз. Продолжительность сушки зависит от скорости испарения подвижной фазы и химической стабильности хроматографируемых веществ.

5.3. Проявление хроматограмм

Проявление компонентов на хроматограмме проводят одним из способов, приведенных ниже.

5.3.1. Физические методы

Визуально, при дневном свете, отмечают на хроматограмме положение пятен - цветных веществ. При наличии флуоресцирующих веществ проявление проводят в УФ-свете.

5.3.2. Химические методы

Хроматограммы проявляют жидкими и газообразными проявителями, используя реакцию имеющихся на хроматограмме соединений с подходящим реагентом-проявителем с образованием окрашенного или флуоресцирующего вещества. Жидкие проявители наносят пульверизатором или используют реагенты в аэрозольной упаковке, газообразные применяют, поместив хроматограмму в пары проявителя.

5.3.2.1. Хроматограмму кладут горизонтально на лист фильтровальной бумаги или оставляют подвешенной на стеклянной палочке и опрыскивают как можно более мелкими каплями (туманом) проявителя всю площадь хроматограммы вначале с одной, а потом с другой стороны.

5.3.2.2. При проявлении газообразным проявителем хроматограмму подвешивают в камере, в которую помещен летучий реагент (например, кристаллы йода), или на дне которой проявитель получают химическим путем (например, оксиды азота получают путем добавления твердого нитрита натрия к раствору соляной кислоты).

5.3.3. Биологические методы

Хроматограммы проявляют, используя биологическую активность хроматографируемых веществ.

6. ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ ИСПЫТАНИЙ

6.1. Качественная оценка хроматограммы заключается в определении положения пятна или полосы, которое характеризуется значением .

где - расстояние от центра пятна пробы до стартовой линии, мм;

- расстояние от фронта растворителя до стартовой линии, мм,

или значением :

где - расстояние от центра пятна вещества сравнения до стартовой линии, мм.

6.2. Определение количества искомого компонента в пробе проводят путем сравнения размеров и интенсивности окраски его пятна с пятнами вещества сравнения, нанесенными на бумагу в интервале значений концентрации, указанных в нормативно-технической документации на испытуемый реактив, и обработанными в условиях испытания. Оценку проводят визуально или с помощью аппаратуры (например, денситометра, устройства для сканирования пятен компонентов на бумаге), или путем элюирования пятен и последующего фотометрического определения оптической плотности растворов.

6.3. Хроматограммы хранят в условиях, препятствующих появлению взаимных оттисков хроматограмм (например, с прокладками из фильтровальной бумаги). Если характер пятен позволяет, то на хроматограммы наносят слой быстросохнущего лака. В случае необходимости проводят зарисовку контура хроматограммы или фотографирование.

ПРИЛОЖЕНИЕ 1 (справочное). ПРИМЕРЫ ОБОРУДОВАНИЯ ДЛЯ БУМАЖНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ И СПОСОБОВ ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ

ПРИЛОЖЕНИЕ 1
Справочное

Черт.1. Камера для восходящей и нисходящей хроматографии

Камера для восходящей и нисходящей хроматографии

Черт.2. Камера для горизонтальной хроматографии

Камера для горизонтальной хроматографии

1 - камера; 2 - решетка из стеклянных палочек; 3 - стеклянная палочка для прижатия конца хроматограммы; 4 - крышка; 5 - хроматограмма; 6 - растворитель

Черт.3. Камера для круговой хроматограммы (две чашки Петри)

Камера для круговой хроматограммы (две чашки Петри)

1 - бумажный фитиль; 2, 4 - чашки Петри; 3 - круговая хроматограмма; 5 - растворитель

Черт.4. Способы расположения хроматограммы при восходящей хроматографии

Способы расположения хроматограммы при восходящей хроматографии

1 - хроматограмма; 2 - хроматографическая камера; 3 - растворитель

Черт.5. Способ вкладывания бумажной хроматограммы в желобок

Способ вкладывания бумажной хроматограммы в желобок

1 - хроматограмма; 2 - старт; 3 - стеклянная палочка; 4 - загнутая палочка для прижатия хроматограммы в желобке; 5 - желобок

ПРИЛОЖЕНИЕ 2 (справочное). ТЕРМИНЫ И ОПРЕДЕЛЕНИЯ

ПРИЛОЖЕНИЕ 2
Справочное

1. Доказательство присутствия ожидаемого вещества или его примеси, оценка хроматографической однородности, проводимая в сопоставлении с известным веществом сравнения.

2. Идентификация вещества, подтверждение идентичности испытуемого вещества с известным веществом.

При данных условиях для каждого соединения характерно определенное местонахождение на хроматограмме () и определенное поведение при проявлении (окраска, флуоресценция). Идентификацию проводят непосредственным сравнением пятен известного и испытуемого вещества на одной хроматограмме или элюированием вещества из хроматограммы и последующей идентификацией, например измерением соответствующего спектра.

3. Определение одного или более веществ в смеси, проводимое одним из следующих методов:

а) субъективной оценкой хроматограммы (например, с помощью калибровочной хроматограммы);

б) объективной оценкой хроматограммы;

в) последующим определением некоторых компонентов физико-химическим методом (например, по элюировании вещества с хроматограммы его определяют спектрофотометрически).

4. Установление структуры органических соединений. Сочетанием реакций разложения с хроматографической идентификацией продуктов этих реакций можно установить структуру молекулы.



Электронный текст документа
подготовлен ЗАО "Кодекс" и сверен по:
официальное издание
Реактивы. Методы приготовления
реактивов и растворов: Сб. ГОСТов. -
М.: ИПК Издательство стандартов, 2008

Распределительная хроматография основана на свойстве разделяемых компонентов различно распределяться между двумя несмешивающимися или слабосмешивающимися жидкими фазами. Одна из жидких фаз является неподвижной фазой, она прочно удерживается на поверхности твердого вещества - «носитетеля» - в виде мономолекулярного слоя жидкости. В другой фазе - подвижной - растворяют исследуемую смесь, нанесенную на носитель.

В процессе хроматографирования происходит перераспределение веществ смеси между двумя несмешивающимися жидкими фазами. Скорость передвижения отдельных компонентов различна, что обусловливает возможность выделения их из сложной смеси. В практике исследований наиболее широко распространен метод распределительной хроматографии на бумаге.

Распределительная хроматография на бумаге. Носителем при служит воздушносухая фильтровальная бумага, а содержащаяся в ней гигроскопическая вода является неподвижной фазой. В качестве подвижной фазы применяют несмешивающиеся или частично смешивающиеся с водой органические растворители.

При получении хроматограмм по методу бумажной хроматографии на край полосы фильтровальной бумаги наносят каплю исследуемого раствора, затем полосу погружают в специально предназначенную для хроматографирования стеклянную ванночку, содержащую подвижный растворитель. При продвижении растворителя по бумаге отдельные компоненты смеси также перемещаются, но с различной скоростью, что обеспечивает разделение смеси.

Хроматограммы получают в герметических камерах в атмосфере, насыщенной парами органического растворителя и воды. Полученные хроматограммы высушивают и для проявления разделенных веществ опрыскивают (проявляют) реактивом, который образует окрашенные соединения с выделенными веществами, что позволяет определить расположение их на полосе бумаги. В определенных условиях опыта распределение отдельных веществ в обеих жидких фазах характеризуется постоянным коэффициентом Rf.

Коэффициент распределения Rf определяется отношением расстояния (в см), пройденного испытуемым раствором, к расстоянию (в см), пройденному растворителем. Воспроизводимость значений Rf зависит от условий проводимых исследований (качества бумаги, степени чистоты растворителей, температуры, состава газовой атмосферы и т.д.).

Различают несколько вариантов бумажной хроматографии: восходящая - растворитель движется снизу вверх, нисходящая - растворитель движется сверху вниз и радиальная (круговая) - растворитель движется от центра к окружности. Кроме того, применяют одномерную и двухмерную хроматографию; при одномерной хроматографии разделение веществ проводят в одном направлении, при двухмерной - в двух взаимно перпендикулярных направлениях.

Одномерная хроматография. Одномерная хроматография наиболее проста и применяется для исследования несложных смесей, для проверки чистоты вещества, для идентификации веществ.

При одномерной хроматографии методика определения заключается в следующем. На полосу хроматографической бумаги на расстоянии нескольких сантиметров от края наносят определенное количество исследуемого раствора. Бумагу помещают в ванночку с растворителем, находящуюся в камере, используя методику восходящей или нисходящей хроматографии (рис. 11). Растворитель при этом продвигается и, когда до конца остается примерно 2 см, процесс прекращают, хроматограмму вынимают из камеры, отмечают фронт растворителя и высушивают при температуре 100° С для удаления растворителя.

Хроматограмму проявляют обработкой специальным реактивом и по расположению образовавшихся цветных пятен на хроматограмме устанавливают Rf для определенного вещества, учитывая расстояние от исходной точки нанесения раствора до середины соответствующего пятна. Затем по специальным таблицам можно определить, какому веществу (например, какой аминокислоте) соответствует пятно. Обычно для идентификации веществ используют одновременно полученную хроматограмму известных веществ - «свидетелей». По совпадению расположения пятен этих хроматограмм устанавливают идентичность веществ.

Двухмерная хроматография. Двухмерную хроматографию применяют для разделения сложных смесей, например для характеристики аминокислот, получаемых при гидролизе белков. Этот хроматографический метод заключается в том, что разделение веществ проводят в два приема, двумя растворителями во взаимно перпендикулярных направлениях.

Радиальная (круговая) хроматография. Для радиальной хроматографии применяют круглые фильтры, которые делят простым карандашом на ряд одинаковых по размеру секторов и проводят две окружности - одну на расстоянии 1 - 1,5 см от центра и вторую на расстоянии 5 см. На линию первой окружности (стартовой) в каждом секторе наносят капли исследуемого раствора, а вторая окружность является границей хроматограммы. В центре бумажного диска делают отверстие, вставляют бумажный фитиль, который погружают в растворитель.

Поднимаясь по бумажному фитилю, растворитель переходит на бумажный диск и, распространяясь по бумаге, переносит компоненты, находящиеся в капле, от центра к окружности. В качестве камер применяют чашки Петри с высокими бортами. Радиальная хроматография является наиболее простым и быстрым методом хроматографического разделения веществ. При этом методе достигается высокий эффект разделения.

При количественном анализе методом бумажной хроматографии на бумагу наносят определенный объем исследуемого раствора. Если анализируют растворы с небольшой концентрацией исследуемых веществ, то капли наносят несколько раз, каждый раз подсушивая нанесенное пятно, затем проводят хроматографическое разделение.

Для количественного определения выделенных веществ пользуются следующим приемом. Из полученной хроматограммы вырезают участок, содержащий выделенное вещество, элюируют его растворителем и определяют его концентрацию при помощи спектрофотометра или фотоэлектроколориметра.

В настоящее время получили развитие следующие виды хроматографии на бумаге: одномерная, двумерная, круговая и электрофоретическая. Одномерную и двумерную выполняют в двух вариантах (рис. 6); восходящим и нисходящим потоком растворителя.

Рис.6

Одномерная восходящая хроматография. (рис. 6 а). 1-5 мкл исследуемого раствора капилляром наносит на полосу хроматографической бумаги в 2 см от нижнего края. Если неподвижная фаза - вода, то бумагу специально не обрабатывают, так как воздушно-сухая бумага содержит до 20 - 22% влаги. Подвижную фазу, насыщенную неподвижной, наливают на дно сосуда для хроматографирования (в цилиндр или пробирку).

Полосу бумаги нижним карем опускают в жидкость, а верхний край закрепляют так, чтобы бумага свободно свисала вниз, не касаясь стенок сосуда. Под действием капиллярных сил подвижная жидкость поднимается вверх по бумаге и разделяет компоненты смеси, которые при различных значениях Rf движутся по слою бумаги с неодинаковыми скоростями. Опыт считается законченным, когда фронт подвижной фазы почти достигнет верхнего края бумажной полосы. После этого хроматограмму извлекают из сосуда, отмечают линию фронта, высушивают и проявляют.

Ширина полосы обычно 2 - 5 см в случае нанесения одной пробы. Длина ее определяется условиями разделения. При одновременном хроматографировании ряда растворов берут широкую полосу бумаги; вдоль ее нижнего края проводят линию старта, на которую наносят капилляром исследуемые растворы на расстоянии 2--3 см друг от друга.

Одномерная нисходящая хроматография.

В верхней части цилиндра (см. рис. 6б.) укрепляют небольшую ванночку, в которую наливают подвижный растворитель, насыщенный неподвижным. На дно цилиндра помещают бюкс с неподвижным растворителем, насыщенным подвижным. Это создает в цилиндре атмосферу насыщенных паров, предотвращающих испарениерастворителя с бумаги.

На, полоску бумаги на расстоянии 5 см от верхнего края наносят каплю исследуемого раствора; край полоски погружают в ванну с подвижной фазой. Растворитель из ванны стекает под действием капиллярных сил и силы тяжести вниз по бумаге. Опыт считается законченным, когда фронт растворителя, достигнет 3-- 5 см от нижнего края бумаги.

Круговая хроматография . Для получения круговой хроматограммы в центр круга хроматографической бумаги вносят каплю исследуемого раствора. Работу удобно проводить в эксикаторе. Диаметр бумажного круга должен быть на 2--3 см больше диаметра нижней узкой чисти эксикатора. Круг укладывают над узкой частью эксикатора, в которую налита смесь неподвижного и подвижного растворителей. Для подачи растворителя в круге вырезают полоску от края круга до центра («фитиль»), отгибают ее вниз и опускают в растворитель. На полученной хроматограмме разделяемые вещества образуют концентрические круги.

Двумерная хроматография. Если одним растворителем разделить сложную смесь не удается, применяют последовательно два растворителя с разными коэффициентами распределения.

Для двумерной хроматографии применяют квадратные листы бумаги размером 20X 20, 30X30, 40X40 см. В начале опыта исследуемый раствор наносят на бумагу в ее левом углу на расстоянии 5 см от левого и от нижнего краев. После высушивания пятна бумагу помещают в сосуд для хроматографирования, опускают нижний край в один из выбранных растворителей и хроматографируют по восходящему методу. После высушивания бумагу, повернув на 90° против часовой стрелки, помещают в новый сосуд для хроматографирования, содержащий второй растворитель, и хроматографируют по восходящему методу. После проявления получают двумерную хроматограмму.

Бумага для хроматографирования. В распределительной хроматографии к бумаге предъявляются следующие требования: она должна быть химически чистой, химически и адсорбционно нейтральной, однородной по плотности, обеспечивать определенную скорость движения растворителя. В СССР выпускают четыре сорта хроматографической бумаги: № 1, 2, 3, 4. Каждый номер отличается от другого по плотности, а следовательно, и по скорости движения растворителя. Бумага № 1 и 2 называется «быстрой», а № 3 и 4 -- «медленной». Хроматографическая бумага должна содержать достаточное количество неподвижной фазы. Обычные сорта бумаги гидрофильны, поэтому в случае применения воды в качестве неподвижной фазы не требуется специально увлажнять бумагу.

Для разделения некоторых смесей нерастворимых в воде органических соединений целесообразно гидрофильную бумагу превратить в гидрофобную. Для этого бумагу ацетилируют, обрабатывая 10 г бумаги смесью 9 мл уксусного ангидрида, 100 мл петролейного эфира и 8--10 капель концентрированной серной кислоты. После ацетилирований бумагу пропитывают различными гидрофобными веществами (1%-ный раствор парафина в петролейном эфире, 0,5%-ный раствор каучука в бензоле и т. п.). Первостепенное значение для разделения смеси хроматографическим путем на бумаге имеет правильный выбор растворителей. В табл. 7 приведены подвижные фазы, наиболее часто применяемые в бумажной хроматографии для разделения смесей (неподвижная фаза -- вода).

Проявление бумажных хроматограмм . В большинстве случаев хроматограмма на бумаге после высушивания остается бесцветной. Поэтому полученные хроматограммы проявляют. Для этой цели служат растворы различных веществ, при взаимодействии которых с компонентами анализируемой смеси образуются окрашенные соединения. Качественно обнаружить вещества в проявленной хроматограмме можно и по люминесценции в ультрафиолетовом свете.

Для идентификации компонентов смеси на хроматограмме применяют метод «свидетелей». Этот метод основан на том, что коэффициент распределения Rf практически не зависит от присутствия посторонних веществ.